حذف توالی his-tag و ساخت یک سازه جدید حاوی ژن آلفا سینوکلئین، مطالعه بیان پروتئین، خالص سازی، فیبریلاسیون و سمیت سلولی پروتئین

در بیان و خالص سازی پروتئین های نوترکیب از توالی مکملی معروف به دنباله استفاده میشود که از انواع آنها می توان به his-tag، gst-tag، mbp-tag وstrep-tag اشاره نمود. وجود این توالیها موجب تسهیل وتسریع امر خالص سازی میگردد و در این میان his-tag پرکاربردترین این توالی هاست. در بسیاری از مواقع حضور این دنباله ها میتواند تاثیر منفی بر روی ساختار و عملکرد پروتئین داشته باشد اما در مطالعات معمولا این مسئله در نظر گرفته نمیشود. در این مطالعه به بررسی اثر حضور his-tag بر روی فرآیندهای فیبریلاسیون و سمیت سلولی آلفاسینوکلئین پرداخته شد و روش خالص سازی مناسب برای پروتئین بدون دنباله طراحی گردید. آلفاسینوکلئین پروتئین مونومری است که در سلولهای مغزی بیان میشود و نقش مهمی در بیماریهای تحلیل برنده سیستم عصبی ازجمله پارکینسون ایفا میکند و به همین دلیل مطالعات وسیعی برروی آن حتی درمدلهای برون تنی صورت میگیرد. آلفاسینوکلئین برچسبدار با هیستیدین در باکتری e.coli بیان شد و توسط کروماتوگرافی تمایلی خالص گردید. برای مقایسه، توالیhis-tag در وکتور توسط آنزیم های ndei و hindiii برش زده، حذف گشته و سپس در e.coli بیان شد و با بکارگیری روش متفاوت خالص سازی با کمک حرارت، خاصیت شلات کنندگی edta و رسوب دهی با ایزوپروپانول پروتئین بدون دنباله با خلوص بالای 95% خالص شد. در مرحله بعد فعالیت فیبریلاسیون هر دو پروتئین برچسب دار و بدون برچسب توسط تستهای استاندارد بررسی شد و تفاوت آن دو از نظر کینتیک تشکیل فیبریل مشخص گردید. his-tag باعث افزایش سرعت فیبریلاسیون می شود که این یافته توسط نتایج پیش گویی نیز ثابت شد. ازساعت های مختلف فیبریلاسیون هر دو پروتئین، نمونه برداری شد و به محیط کشت سلولی اضافه گردید و با تست mtt ثابت شد که نمونه 3 ساعته پروتئین his-tag دار و نمونه 7 ساعته آلفاسینوکلئین بدون his-tag بیشترین مرگ سلولی را دارند. این نتیجه نشان می دهد کهhis-tag باعث تسریع فیبریلاسیون می شود و قاعدتا مقدار بیشتری از سلول ها در نمونه 3 ساعته دچار آسیب می شوند اما همین نتیجه، برای نمونه 7 ساعته پروتئین بدون his-tag دیده می شود..